引物设计原则（注意事项）

引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板 DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则： 1、引物最好在模板cDNA 的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2、引物长度：引物长度一般15-30bp，常用为20bp左右。因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
4、引物应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构（Hairpin）。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
5、引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3’端的互补重叠以防形成引物二聚体
6、引物5’端可以修饰。引物的5’端决定PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大。因此可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。
7、引物3’端不可修饰。引物的延伸是从3’端开始的，不能进行任何修饰。3’端也不能有形成任何二级结构的可能，除在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3’端不能发生错配。 8、引物3’端要避开密码子的第3位。在扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因为密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 9、避开产物的二级结构区。某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 10、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 11、引物的特异性：特异性是指针对DNA片段设计出来的引物只能扩增出此DNA片段（扩增产物应该是单一条带），而不能扩增出其他DNA片段。引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。